苯丙酮尿症可以通过新生儿疾病筛查、尿蝶呤图谱分析、红细胞DHPR活性测定、四氢叶酸生物蝶呤负合实验、脑电图、脑核磁共振、产前检查等来确诊。上述检查一定要在专业医生指导下进行检查确诊。
1、新生儿疾病筛查：新出生的婴儿3~7天左右采取足跟血，滴在采血滤纸上，送到实验室进行苯丙氨酸浓度测定。苯丙氨酸浓度正常为小于120umol/L，如果出现增高，大于120umol/L，考虑是患有苯丙酮尿症。
2、尿蝶呤图谱分析：主要适用于BH4缺乏症的鉴别诊断，尿蝶呤谱采用高压液相分析尿中新蝶呤N，和生物蝶呤B，如果尿中新蝶呤明显增加，生物蝶呤极低，N/B比值增高，考虑是患有苯丙酮尿症。
3、红细胞DHPR活性测定：是指二氢生物蝶呤还原酶缺乏症时，该酶活性降低，医生一般会采用双光束分光光度计，测定血片中的红细胞DHPR活性。
4、四氢叶酸生物蝶呤负合实验：对于轻度苯丙酮尿症或者是以用特殊饮食治疗的血苯丙氨酸浓度已降低者，可采用尿蝶呤分析以及DHPR活性测定。不能确定的可以进行四氢生物蝶呤负荷试验。
5、脑电图：对于有抽搐的患儿，需要及时做脑电图，应用抗癫痫药物。
6、脑核磁共振：主要是评价患儿脑损伤的程度。
7、产前检查：如果家族中有苯丙酮尿症患者及其父母致病基因变异明确，需要到医疗机构进行产前诊断以及后续的遗传咨询。
苯丙酮尿症一定要在医生指导下进行检查确诊。确诊后要立即治疗，治疗年龄越小，恢复越好，采用低苯丙氨酸配方奶进行治疗，治疗时仍需监测苯丙氨酸浓度。